贴壁、悬浮、原代细胞感染专用Protocol及常见问题解答

慢病毒是当前*热门的基因操作工具，其感染谱广，可有效地感染肿瘤细胞、神经元细胞、心肌细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而为基因功能的研究提供了更强有力的工具。然而仍有一部分细胞，尤其是原代细胞和悬浮细胞由于细胞特性，很难获得高效的感染效率。为了提高细胞的感染效率，我们常常选择多加病毒或使用Polybrene等助感染试剂，然而细胞状态却变差了，且增加感染效率并没有达到理解的效果，这是什么原因呢？
 
一、对慢病毒感染出现的问题进行原因分析

1. 细胞状态变差——细胞毒性 

• 杂质：病毒溶液中残留的杂质蛋白、内**及宿主细胞DNA等是造成细胞毒性的主要因素。特别对于某些外源刺激敏感的细胞来说，严重时将导致细胞死亡。这是病毒感染细胞后，状态差异的主要原因。
• 过度感染：外源基因过度表达，会导致目的细胞本身正常新陈代谢失衡。这是有些细胞过感会死亡的主要原因。

2. 病毒加了不少，效果不理想，如何增加感染效率——了解影响慢病毒感染效率的因素
 

• 细胞膜的流动性
• 细胞膜表面受体的表达丰度
• 病毒与细胞的接触面积和接触几率
• 细胞膜与病毒外壳蛋白电荷的多少

 
二、如何有针对性地增加慢病毒感染效率

了解了影响细胞状态和感染效率的原因后，我们就可以有针对性的进行调整。
 
1.  使用高滴度高纯度的慢病毒，可以减少病毒中的杂质对细胞状态的影响：降低慢病毒对细胞的毒性
2.  调整细胞状态，感染时使用对数期的细胞：增加细胞膜的流动性
3.  降低感染时血清浓度，使用无血清/低血清的培养基：降低血清蛋白对病毒外壳蛋白的封闭
4.  离心法，感染时将细胞培养板密封，用平角转子离心机1000g离心1h，再放回培养箱中正常培养：增加慢病毒与细胞的接触几率，但对细胞有一定的机械损伤，仪器要求高
5.  感染时加入Rentronectin等纤粘蛋白：增加慢病毒与细胞接触几率，但会影响细胞的贴壁状态
6.  使用传统的助感染试剂，如Polybrene：中和细胞膜和病毒粒子之间的电荷排斥，但Polybrene本身就具有细胞毒性，部分细胞对Polybrene敏感，容易导致细胞状态变差、形态发生变化、甚至死亡。

三、特殊细胞慢病毒感染注意事项

1. 悬浮细胞
    对于悬浮细胞，可采用离心感染方法提高感染效率。如将细胞培养板密封后，用平角转子离心机1000g离心1h，再放回培养箱中正常培养。
 
2. 极难感染的细胞
    对于极难感染的细胞，可采用多次感染的方法，即感染一次后，重新加入新鲜病毒再次感染，可显著提升感染效率。但需要注意调整两次感染间细胞状态。
 
3. 传代能力较差的原代细胞、非分裂细胞
    原代细胞：由于细胞增长缓慢，可以在接种时提高汇合度到50%～60%，确保在感染后4天时细胞汇合度达到90%～100%；
    非分裂细胞：如神经元细胞，接种后不再增殖，需要按照100%的汇合度进行接种。 


 


Q：慢病毒如何稀释？
A：用常规培养基、生理盐水、Hanks液、PBS液等将慢病毒稀释到需要的滴度。如原病毒标记滴度为5 x 10⁸ TU/ml，则取20 µl病毒液加入到80 µl的常规培养基中，即可得到1 x 10⁸ TU/ml的病毒稀释液。
 

Q：如何确定向细胞中加入慢病毒的*佳时间？
A：慢病毒感染细胞后需要4天的时间才能观察到慢病毒携带的基因表达，应在细胞汇合度20~40%时且细胞状态良好时加入慢病毒，确保在感染后4天时细胞增长达到90%～100%的汇合度。
 
Q：加入慢病毒病毒后，细胞死亡很厉害，该如何处理？
A：这种情况是由于慢病毒对该细胞有一定的毒性作用，需要调整并降低感染的MOI值，并且在感染后4小时、8 小时、12 小时对细胞进行观察，若发现细胞状态变差时，则需要立刻对细胞进行换液操作，使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液。
 
Q：如何提高慢病毒对细胞的感染效率？
A：慢病毒对细胞的感染效率受多个因素影响，如细胞自身生长的状态，细胞数量，细胞被慢病毒感染的难易程度等。因此保证细胞正常增殖，轮廓清晰，合适的细胞密度，选择*优的感染条件可以更好的保证感染效率。对于悬浮细胞，可采用离心感染方法，减少病毒感染时的体积，从而提高感染效率。如将细胞培养板密封后，用平角转子离心机1000g离心1h，再放回培养箱中正常培养。