流式细胞术的常用样品制备方法

流式细胞术的实验检测对象是单细胞悬液，因此，在组织化学和**组织化学实验中欲对待测样品细胞进行分类计数，也需把样品制备成细胞悬液，并要求被检细胞大小为0.2～80pm，每个样品中至少有20 000个细胞，细胞浓度为10⁵ ～10⁷ 个／ml。制备成的单细胞悬液经荧光或**荧光标记即可上机检测。

       一．单层培养细胞单细胞悬液的制备
       1. 弃去培养细胞(对数生长期)中的旧培养液，加入1～2ml 0.25％胰蛋白酶，倒置显微镜下观察，见细胞稍变圆时，停止胰蛋白酶作用。也可直接观察培养瓶，静置消化2～3分钟，待细胞逐渐变白，有脱落趋势时，立即竖立培养瓶，停止胰蛋白酶作用，弃去胰蛋白酶；

       2. 加入3～4ml无钙离子和镁离子的PBS液，用吸管反复吹打，使其分散为单个细胞悬液，移入离心管中；

       3.离心，去掉上清液，加入约0.5mlPBS液，用振荡器使细胞分散；
       4.用细滴管或注射器将细胞迅速注入4℃ 70％乙醇中，保存于4℃冰箱中备用。

      二．实体组织单细胞 悬液的制备

      1.机械法
       ①用剪刀剪碎或者用锋利的解剖刀剁碎组织；
       ②将剪碎的组织加入匀浆器中匀浆；
       ③用吸管或注射器抽吸细胞悬液，以分散细胞；
       ④将细胞悬液在尼龙网或不锈钢网上过滤，滤出的细胞悬液细胞计数后即可使用。

      2. 酶处理法 
       此法是实体组织分散为单个细胞的主要方法。由于不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异消化作用，所以应根据所用组织类型确定使用酶的种类。此外，乙二胺四乙酸(EDTA)能结合组织中的二价钙离子和镁离子，而二价钙离子和镁离子有维持细胞表面完整性和维持细胞间质结构的作用，因此，几种酶和EDTA联合使用有助于充分消化实体组织，提高细胞产出效率。下面仅介绍组织消化的一般过程，对于每种组织消化时所用的具体步骤需参考该组织细胞培养时的消化方法。
       ①将组织剪成1～2mm³左右的小块。
       ②用胰蛋白酶或胶原酶消化组织块，胰蛋白酶适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织。胰蛋白酶工作浓度一般为0.1％～0.5％。对于纤维较多的组织或较硬的癌组织常用0.25％胶原酶，胶原酶对组织中胶原蛋白类结构消化作用强，它仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。胶原酶常用剂量为0.1～0.3ug／ml。用大于组织量30～50倍的胰蛋白酶液或胶原酶液在37℃条件下消化组织，需每隔一定时间摇动一次。消化时间的长短依组织类型而定，一般来说，胰蛋白酶需作用20～60分钟，胶原酶需4～48小时。在消化过程中，如发现组织块已分散而失去块的形状，经摇动即可成为絮状悬液，则可取出少量液体在显微镜下观察，可见分散的单个细胞和少量的细胞团，可认为组织已消化充分。
      ③消化完毕后，将细胞悬液通过100目孔径尼龙网或不锈钢网滤过，以除掉未充分消化的组织。
      ④已过滤的细胞悬液经800～1000rpm低速离心5～10分钟后，弃上清液，加PBS液，轻轻吹打形成细胞悬液，细胞计数后即可使用。
 
      三．石蜡包埋组织的流式细胞样品制备 
      外科手术获得的新鲜实体组织，往往已进行石蜡包埋处理，如果再制成细胞悬液进行流式细胞分析，需将石蜡包埋组织进行以下步骤的处理：
      1.将石蜡包埋的组织块切成30／xm厚的切片，尽可能除去切片中石蜡成分；
      2.将切片置于离心管中，用二甲苯脱蜡2次，10分钟／次；
      3.蒸馏水洗2次后，加入1ml 1％胃蛋白酶溶液中(pH 1.5)，37℃恒温振荡水浴中消化30分钟；   
      4.离心，所获得的细胞沉淀可进行染色和流式细胞术分析。